Synteza i właściwości D-glikozaminozydów diosgenylu

Saponiny to zróżnicowana pod względem strukturalnym grupa glikozydów szeroko roz­pow­szechnionych w przyrodzie, głównie w królestwie roślin. Najczęściej spoty­kanymi sa­po­ninami naturalnymi są sa­po­niny triterpenoidowe i steroidowe. Wśród glikozydów steroidowych wyróżnia się saponiny cholestanowe, furostanowe i spirostanowe. Należące do ostatniej klasy są szczególnie ważne z uwagi na szerokie spektrum właściwości biologicznych. Większość saponin została wyodrębniona z preparatów ziołowych stosowanych w medy­cynie ludowej, szczególnie w krajach Azji. W postaci ekstraktów ziołowych, maści, różnego rodzaju naparów są tam stosowane jako leki przeciw malarii, odtrutki przeciwko jadom węży i owadów oraz jako środki antyseptyczne, bakteriobójcze i przeciwwi­rusowe. Aglikon, czyli sapogeninę stanowi w nich m.in. diosgenina.

Fragment hydrofilowy sa­po­nin składa się zwykle z jednej lub kilku jednostek cukrowych. Najczęściej spotykany­mi sacharydami wchodzącymi w ich skład są D-glukoza (D-Glc) i L-ramnoza (L-Rha).[[1]]

W naszym laboratorium uzyskaliśmy serię D-gli­koz­ami­nozydów diosgenylu (Rys. 1) zawierających jako fragmenty cukrowe resztę D-glukoz­aminy lub D-ga­lak­tozaminy. Takie saponiny nie występują w naturze. Ich synteza polega na umiejętnym po­łą­czeniu chronionej D-glikoz­aminy – stano­wiącej donor glikozylu – z akceptorem glikozylu, tj. dios­ge­niną. Do osłony grupy ami­nowej najczęściej stosowaliśmy osło­nę tetra­­chloro­fta­lo­ilo­wą, a grupą odchodzącą przy ano­me­rycznym atomie węgla był anion halogenowy.[[2],[3],[4],[5]] Po uzyskaniu glikozydu, następnym etapem było usunięcie osłon acetylowych i osłony z funkcji aminowej.

W kolejnych etapach dokonaliśmy funkcjonalizacji grupy aminowej. Otrzymaliśmy kilkadziesiąt pochodnych, m.in. chlo­rowodorki 1 i 2, pochodne acetylowe 3 i 4, z ugrupowaniem mocznikowym 5÷7, kilka N-alkilowych – saponiny 8÷11 i 16, N,N-di­alki­lo­wych – glikozydy 12÷15, 17 i 18 oraz kilkanaście N-acylowych pochodnych zwierających reszty aminokwasów, m.in. D- i L-alaniny, sarkozyny, L-seryny, L-treoniny czy L-proliny – saponiny 19÷24 (Rys. 2).

    Rys. 2.

Chlorowodorki zostały otrzymane po sprotonowaniu grupy aminowej roztworem HCl w MeOH. Procedury modyfikacji funkcji aminowej polegały na jej acetylowaniu bezwodnikiem octowym, reakcji z komercyjnie dostępnymi izocyjanianami fenylu i 2-chloroetylu oraz reduk­cyj­nym aminowaniu (reakcja z aldehydem i redukcja NaBH₃CN). Natomiast do syntezy saponin z re­sz­tami aminokwasów wykorzystaliśmy klasyczną metodę syntezy w roztworze, polegającą na utworzeniu wiąza­nia amidowego pomiędzy grupą karboksylową aminokwasu bądź hydroksykwasu a funk­cją aminową w D-glukozaminozydzie diosgenylu.

Uzyskane saponiny zostały w różnym stopniu przebadane pod kątem ich aktywności przeciwnowotworowej i/lub przeciwdrob­no­ustro­jowej (bakterie i grzyby).

W najszerszym za­kresie został zbadany chlorowodorkek 2-amino-2-de­oksy-β-D-glu­ko­pira­no­zy­du diosgenylu (1). Ba­dania przeciwnowotworowe chlo­rowodorku 1 i saponiny 5 polegały na określeniu ich wpływu na limfocyty wyizolowane z krwi pacjentów cierpiących na chłoniaka a leczonych 2-chlo­­ro­deok­sy­ade­no­zy­ną (2-CDA, kla­dry­bina). Obie saponiny wykazują cytotoksyczność wobec tych limfocytów.[2]

Kolejne badania in vitro i in vivo dla 1 przeprowadziliśmy na szczepach (referencyjnych i szpi­talnych) bakterii Gram-dodat­nich, ustalając minimalne stężenie hamujące w 50% i 90% (MIC_{50 i 90}) oraz minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC₅₀ i ₉₀). Badania prowadziliśmy dla szczepów metycylino- i wankomycyno-opornych (MR i VR) oraz metycylino- i wankomycyno-wrażli­wych (MS i VS) gronkowca zło­cistego (Staphylococcus aureus) i paciorkowca kałowego (Enterococcus fae­calis). Jako związki kontrolne stosowaliśmy ogólnodostępne antybiotyki, m.in. imipenem, doksycyklinę, eryt­ro­mycynę, cyproflok­sacynę. Wyniki ba­dań dla saponiny 1 są porównywalne z re­zultatami uzyskanymi dla wzorcowych antybiotyków. Zaobserwowaliśmy również, że stosowanie 1 z wankomycyną oraz daptomycyną prowadzi do uzyskania efektu synergistycznego wobec szczepów metycylino- i wankomycyno-wrażliwych (FIC w granicach 0,312÷0,458). Nie zaobserwowaliśmy efektu antagonistycznego.[[6]]

Biorąc pod uwagę rezultaty synergizmu przeprowadziliśmy badania in vivo na albinotycznym szczepie wsobnym myszy BALB/c. Jako anty­bio­tyk referencyjny wybraliśmy wanko­mycynę. Naj­większe bakteryjne zahamowanie uzyskaliśmy dla tkanki zakażonej gronkowcem lub paciorkowcem, która została potraktowana mieszaniną naszej saponiny i antybiotyku.[6]

Otrzymane saponiny badaliśmy również pod kątem zwalczania drobnoustrojów jakimi są grzyby. Tę aktywność badaliśmy na szczepach referencyjnych gatunków za­li­cza­nych do drożdżaków Candida albicans i Candida tropicalis.[4,5] Wobec Candida najlepszą aktywność wykazała saponina 1 (MIC = 0,5 i 2 μg/ml, odpowiednio dla C. tropicalis i C. albicans). W następnej kolejności są trzy N,N-dialkilowe saponiny 12÷15 o krótkich łańcuchach węglowych (1÷3 atomów węgla) z MIC = 1÷4 μg/ml. Znacznie słabsze rezultaty otrzymaliśmy dla N,N-dialkilowych pochodnych o dłuższych łańcuchach węglowych (4÷6 atomów węgla), a saponiny N-mono­alkilowe 8÷11 należy uznać za mało aktywne. Aktywność rzędu 4 μg/ml wobec C. albicans wykazywała także większość pochodnych zawierających reszty aminokwasowe – 19÷24.

Podobne testy wykonaliśmy dla D-galaktozaminozydów. Zmiana konfiguracji atomu węgla C-4 w pierścieniu cukrowym wpłynęła niekorzystnie na aktywność chlorowodorku 2 w porównaniu z jego odpowiednikiem D-gluko, hamuje on wzrost obydwu grzybów w mniejszym stopniu (dla C. tropicalis MIC = 4 µg/ml a dla C. albicans zaledwie 64 µg/ml). Jedynie wyniki dla N,N-dialki­lo­wych pochodnych (dietylo i dipropylo) serii D-gluko 13 i 14 oraz serii D-galakto 17 i 18 są porównywalne (MIC ~ 4 μg/ml). Z kolei saponiny zawierające ugrupowania ureidowe (związki 6 i 7) należy uznać za nieaktywne.

Chlorowodorek D-gluko 1 oraz cztery N,N-dialkilowe pochodne o krótkich łańcuchach (12÷15) testowaliśmy dodatkowo na szpitalnych szczepach grzybów gatunku non-al­bi­cans Candida.[[7]] Rezultaty porównywaliśmy do wzorcowych środków przeciwgrzybiczych, m.in. amfoterycyny B, klotrimazolu, flukonazolu, itrakonazolu. Gatunek C. glabrata (odporny na flukonazol i itrakonazol) okazał się być podatnym na saponiny 1, 12 i 13, które hamowały wzrost grzyba w 90% przy stężeniu 4 μg/ml i niższym. Aż 4 saponiny (1 i 12÷14) wykazały silną aktywność wobec gatunku C. parapsilosis.

Do badań przeciwbakteryjnych użyliśmy po kilka szczepów referen­cyjnych bakterii Gram-ujem­nych, m.in. Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae oraz Gram-dodatnich, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus i S. epidermidis.[4,5]

O ile wszystkie glikozydy okazały się nieaktywne w stosunku do bakterii G(–), to wobec bakterii G(+) większość N-alkilowych i N,N-dialkilowych saponin cechuje się dość różną aktywnością. Najaktywniejszymi okazały się pochodne N-etylowa (8) i N-propylowa (9), zarówno w serii D-glu­ko jak i D-galakto. Pochodne N,N-dialkilowe 12 i 13 wykazują słabszą aktywność od chlorowodorku 1 (MIC = 8÷16 μg/ml), a saponiny 14 i 15 lepszą.[4] O ile pochodne alkilowe serii D-galakto zachowywały się w podobny sposób do D-gluko, to nie można tego powiedzieć o chlorowodorkach obydwu serii.[5] Otóż, chlorowodorek 2 cechuje się brakiem aktywności wobec bakterii G(+). Wśród saponin serii D-galakto warto zwrócić uwagę na aktywność pochodnej 6, zawierającej przy atomie węgla C-2 fragment chloroetylomocznikowy (MIC = 2÷8 μg/ml).

Analizując wyniki aktywności pochodnych 19÷24, zawierających reszty aminokwasów, okazuje się że najwyższą aktywność wykazuje pochodna N-(D-ala­nylowa) (19), nieco słabszą N-sar­kozy­lo­wa (21), N-(L-ala­nylowa) (20) i N-(L-prolilowa) (24), a jeszcze słabszą pochodne zawierające reszty L-hydroksyaminokwasów, tj. N-(L-serylowa) (22) i N-(L-treonylowa) (23).[[8]]

Dodatkowo dla saponin 1, 12÷15 i 19÷24 badaliśmy ich aktywność hemolityczną na ludzkich erytrocytach. Minimalne stężenie powodujące hemolizę (MHC) zostało ustalone jako najniższe stę­żenie, które powoduje przynajmniej 10±0,5% hemolizy. Wyniki badań hemolitycznych pokazały, że wymienione saponiny przy ich mikrobiologicznie aktywnych stężeniach są nietoksyczne dla ludzkich krwinek czerwonych.[7,8]